유의 사항:이 웹 사이트는 수시로 업데이트됩니다. 일부 내용은 모든 내용이 번역될 때까지 영어로 기재되어 있을 수 있습니다.

폐수 감시 검사법

폐수 감시 검사법
2020년 11월 23일 업데이트

폐수 기반 질병 감시를 구현하기 위해 이 지침을 활용하세요. 폐수 기반 질병 감시는 빠르게 발전 중인 과학이며 CDC는 지침과 정보가 들어오는대로 계속 업데이트를 제공할 것입니다.

검사법 개요

미국 전역 폐수에서 SARS-CoV-2를 정량화하기 위해 여러 검사법과 실험실 작업을 이용합니다. 실험실 제어는 분석법 성능과 데이터 품질을 고려하여 결과를 비교할 수 있습니다. 폐수 내 SARS-CoV-2 농도에 맞추어 필요에 따라 분석법을 더 높거나 더 낮은 검출 한계에 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 폐수 속 SARS-CoV-2 RNA 농도가 충분히 높은 경우, 추가 농축 과정 없이 소량의 폐수(예: 1ml)를 검사할 수 있습니다. 검사 방법에는 샘플 처리 단계, 실험실 제어 사용, 공중보건상 유의미한 데이터 해석 여부 확인을 위한 생물학적 안전 조치 구현이 포함됩니다.

SARS-CoV-2 관련 폐수 샘플 처리 과정 및 검사 그림
SARS-CoV-2 관련 폐수 샘플 처리 및 검사 개요

샘플 수집 후 SARS-CoV-2 폐수 검사 첫 번째 단계는 샘플 준비입니다. 이 단계에서 매트릭스 회수 제어를 샘플에 스파이크해야 합니다. 두 번째 단계는 샘플 농축입니다. 세 번째 단계는 농축 폐수 샘플에서 RNA를 추출하는 것입니다. 마지막 단계는 RNA 측정입니다. 이 단계에서 SARS-CoV-2 RNA 측정과 함께 매트릭스 회수 제어, 인간 배설물 정규화, 정량적 측정 제어, 분자 방법 억제 평가를 위한 제어 등 여러 실험실 제어 요인도 측정해야 합니다.

샘플 처리

폐수 속 SARS-CoV-2 RNA 측정을 위한 샘플 처리에는 샘플 준비, 샘플 농축, RNA 추출, RNA 측정 방법이 포함됩니다. 각 단계에서 선택한 방법은 화학생물학적으로 복잡하고 가변적인 혼합물인 폐수에 적합하도록 맞춤화해야 합니다. 적절한 실험실 제어를 통해 이러한 폐수 샘플 처리 절차 성능을 평가합니다. SARS-CoV-2가 들어있을 수 있는 폐수 샘플을 처리하려면 적절한 생물학적 안전 방침에 따라야 하며 이 웹페이지 뒷부분에서 이를 설명합니다.

샘플 준비

폐수 샘플을 적절하게 보관하고 준비하면 SARS-CoV-2 RNA 폐수 측정의 정확성에 도움이 됩니다.

  • 보관: 채취 후 즉시 4° C에서 샘플을 냉장하고 가능하면 24시간 이내에 처리하여 SARS-CoV-2 RNA 분해를 막고 감시 유용성을 증가합니다. 수집 후 24시간 내에 샘플을 처리할 수 없는 경우, 샘플에 매트릭스 회수 제어를 스파이크한 후 4°C에서 냉장하거나 -20°C 또는-70°C에서 냉동해야 합니다.
  • 균질화: 다운스트림 처리를 위해 수집 폐수 일부를 제거하기 전에 액체 폐수와 1차 슬러지 샘플을 모두 잘 혼합해야 합니다. 샘플을 여러 번 뒤집거나(액체 샘플의 경우) 기계 혼합 방식으로 섞습니다. 샘플 균질화에 초음파 처리 등 폐수 고형물을 분해하고 바이러스 입자를 분해하는 절차도 포함할 수 있습니다.
  • 샘플 정화: 큰 고형물을 제거하여 액체 폐수 샘플을 정화하면 샘플 농축할 때 후속 여과 농축 단계에 도움이 됩니다. 고형물을 제거하면 고형물에 붙어있는 SARS-CoV-2 RNA도 제거될 것입니다. 큰 기공 필터(5µm 이상) 또는 원심분리법으로 샘플을 정화할 수 있습니다.

샘플 농축

농축 폐수 샘플은 SARS-CoV-2 RNA 검출을 강화할 수 있습니다. 1차 슬러지 샘플보다 미처리 폐수 샘플의 경우 농도가 더 중요합니다. 샘플 유형 선택에 대한 자세한 내용은 '폐수 샘플링 전략 개발'에서 샘플 채취할 것을 참조하세요.

현재까지 평가된 농도 접근법으로 알게 된 폐수 속 SARS-CoV-2 탐지를 위한 적절한 회수율은 다음과 같습니다.

  • 한외여과
  • MgCl2 첨가 또는 산성화로 샘플을 전처리해 전기 음성막을 통해 여과
  • 폴리에틸렌글리콜(PEG) 침전
  • 탈지 우유 응집
  • 초원심분리

바이러스 농축법을 선택할 때 고려할 점:

  • 샘플 유형: 미처리 폐수 샘플의 경우 위에 설명한 여러 여과법과 침전법을 사용할 수 있습니다. 1차 슬러지 샘플의 경우 원심분리가 고형물을 농축하는 가장 효과적인 방법입니다.
  • 샘플 용량: 대량의 미처리 폐수 샘플 용량은 멤브레인 여과(여과 속도가 느리므로) 또는 PEG 침전(원심분리기 용량에 제한이 있으므로) 전에 시료를 분할해야 할 수 있습니다. 5L보다 큰 샘플 용량은 대용량 카트리지 한외여과와 같이 대용량 농축 설계 방법으로 사전 농축해야 할 수도 있습니다.
  • 잠재적인 공급망 문제: 멤브레인 필터 또는 한외여과 카트리지 등 상업용 여과 제품이 필요한 방법은 다른 방법보다 공급망 문제에 더 민감합니다.
  • 샘플 처리 시간: 농축 방법 선택은 방법 처리 시간과 실험실 직원 가용성에 따라 제한을 받습니다. 탁한 폐수 샘플의 멤브레인 여과는 몇 시간이 걸릴 수도 있습니다.
  • 실험실 장비 가용성: 원심분리기 용량과 성능, 멤브레인 여과 장치 가용성도 분석법 선택을 제한합니다.

RNA 추출

핵산 추출 및 정화는 하수 혼합물에서 SARS-CoV-2 RNA를 분리하는 데 필수적인 단계입니다. 하수는 분자 바이러스 정량화 방법을 방해하는 것으로 알려진 물질이 들어있는 복잡한 혼합물이므로 추출 방법을 선택할 때 다음 사항을 고려해야 합니다.

  • 환경 샘플에서 고순도 핵산 추출물을 생산하도록 개발된 추출 프로토콜을 선택합니다. 환경 샘플 추출에 상용 키트를 사용할 수 있습니다.
  • RNA 정제를 위해 특별히 개발한 추출 키트 또는 프로토콜을 사용하고 용해 전에 RNase 변성제를 포함합니다.
  • 추출액을 별도의 튜브로 나누어 -70°C 이하에서 보관하며 여러 번의 동결-해동 주기를 피해 추출 RNA 분해를 방지합니다.

RNA 측정

검출 방법: RT-qPCR(역전사-정량 중합 효소 연쇄 반응) 또는 RT-ddPCR(RT-비말 디지털 PCR, 다른 형태의 디지털 PCR도 가능하지만 덜 일반적임)을 사용하여 폐수에서 SARS-CoV-2 RNA를 정량화합니다. 각 방법은 RT와 PCR이 동일한 반응 혼합물에서 발생하는 1단계 반응 또는 RT와 PCR이 별도의 순차 반응으로 발생하는 2단계 반응으로 실시할 수 있습니다. 1 단계 RT-ddPCR 프로토콜은 RT를 개별 비말에서 수행하기 때문에 폐수에 유리합니다. RT는 2단계 프로세스에서와 같이 벌크 솔루션 RT에 비해 RT-qPCR에서 RT 억제를 줄일 수 있습니다.

유전자 표적: SARS-COV-2 N(N1 및 N2, CDC 발행) 영역을 표적으로 하는 프라이머와 프로브 E 유전자(E_sarbeco, Corman et al., 2020 EuroSurveillance)는 폐수 속 SARS-CoV-2 RNA 정량화에 민감하고 특이적인 것으로 보고되었습니다. 가능하면 동일한 표적 유전자를 사용하여 폐수 측정값을 비교해야 합니다.

실험실 제어

실험실 제어는 특히 다른 검사법을 사용할 때 시간 경과에 따른 폐수 수원 전반에 걸쳐 SARS-CoV-2 RNA 폐수 농도를 비교하는 데 필수적입니다. CDC는 SARS-CoV-2 폐수 감시에는 다음과 같은 유형의 측정 실험실 제어를 권장합니다.

  • 바탕질 회수율 대조군
  • 인간 배설물 정규화
  • 정량적 측정 대조군
  • 억제 평가
  • 음성 제어

매트릭스 회수 제어

매트릭스 회수 제어(공정 제어라고도 함)를 사용하여 샘플 처리 중에 손실된 바이러스의 양을 이해합니다. 이 컨트롤은 시간에 따른 다양한 검사법을 통한 농도 비교에 중요합니다. 폐수는 화학적 및 생물학적으로 복잡하고 가변적이며 종종 시료 농도, 핵산 추출, 분자 정량화 방법을 방해하는 성분이 들어있기 때문에 회수를 정량적으로 평가하는 것이 중요합니다. 분석법 검증에 매트릭스 회수 제어를 포함해야 하며, 가능하면 폐수 조성의 예상치 못한 변화를 설명하기 위해 각 샘플에 이를 포함시켜야 합니다. 폐수 조건(예: 빗물 유입) 또는 실험실 방법에 변경이 있을 때마다 항상 매트릭스 회수 제어를 포함합니다.

생물학적으로 SARS-CoV-2와 더 유사한 매트릭스 회수 제어는 폐수 샘플에서 SARS-CoV-2 회수를 더 정확하게 나타낼 수 있습니다. 매트릭스 회수 대조군 후보는 뮤린 코로나바이러스(뮤린 간염 바이러스라고도 함), 소 코로나바이러스, 소 호흡기 세포 융합 바이러스를 포함하는 단일 가닥 RNA 게놈이 있는 외피 바이러스입니다.

인간 배설물 정규화

추세를 계산하기 전에 SARS-CoV-2 폐수 농도를 정규화하여 폐수 희석 변화 정도와 시간에 따른 인간 배설물 투입량 차이를 설명해야 합니다. 감시 기간 동안 하수도를 이용하는 사람수가 변할 것(관광, 평일 통근자, 임시 근로자 등으로 인해)으로 예상하는 경우, 폐수 속 사람 배설물 양에 따라 SARS-CoV-2 농도를 정규화합니다. 이는 폐수 속 SARS-CoV-2 농도를 해석하고 시간에 따른 하수 샘플 간의 농도를 비교하는 데 중요합니다. 사람 배설물 정규화 제어는 사람 배설물 함량을 추정할 때 폐수에서 측정할 수 있는 인간 배설물 특유의 유기체 또는 화합물입니다.

인간 정규화 제어에는 다음이 포함되지만 이에 국한되지는 않습니다.

  • 배설물 ​​지표 바이러스 분자 표적: 페퍼마일드모틀 바이러스, crAssphage
  • 배설물 지표 박테리아 분자 표적: 박테로이드 HF183,라크노스피라세 라크노3

인간 배설물 대조군(예: 인간 배설물 대조군 농도에 대한 SARS-CoV-2 비율)을 사용하여 SARS-CoV-2 농도를 정규화하면 폐수 시스템에 유입되는 배설물과 실험실에서 정량화 사이에 발생하는 바이러스 손실을 설명할 수 있습니다. 그러나 인간 배설물 정규화는 방법 성과 평가를 위한 매트릭스 회수 제어를 대체할 수 없습니다.

정량적 측정 대조군

모든 SARS-CoV-2 RNA 정량화 방법에 대한 정량적 측정 제어를 포함해야 합니다. RT-qPCR의 경우 알려진 농도의 제어에서 검량선을 유도합니다. RT-ddPCR의 경우 각 기기 실행 시 알려진 수량의 제어를 포함합니다. 정확한 RNA 표적 정량화를 위해서는 DNA 제어보다 RNA 제어가 바람직합니다. 부분 표본 정량 측정으로 동결-해동주기 반복을 방지하고 -70°C 이하 보관을 제어합니다.

억제 평가

억제 검사를 통해 RNA 정량화 프로세스(RT 및 PCR)가 예상대로 진행되는지 확인합니다. 폐수는 복잡하고 가변적인 혼합물이며 종종 RNA 정량화 방법을 방해하여 측정 정확성을 방해하는 화합물이 들어 있기도 합니다.

몇 가지 접근법을 사용하여 억제도를 평가할 수 있습니다.

  • SARS-CoV-2 RNA 농도가 높으면 추출 RNA의 측정 농도를 예상대로 희석하여 다른 수준으로 희석되었는지 여부를 평가하여 억제를 평가합니다. 이 방법은 샘플에서 SARS-CoV-2를 정량화하는 동일한 반응에서 억제를 직접 평가할 수 있으므로 선호하는 방식입니다.
  • SARS-CoV-2 RNA 농도가 너무 낮아 희석후 정량화할 수 없는 경우 바이러스 RNA(예: 비인간 코로나바이러스의 합성 SARS-CoV-2 RNA 또는 정제 RNA, 매트릭스 회수 제어에서 설명)를 폐수 추출물로 추출하고 측정 농도를 분자 음성 스파이크한 바이러스 RNA(템플릿 제어 없음) 또는 스파이크 추출물 희석과 비교합니다.

억제가 발생하면 추출물을 희석하여 제거할 수 있습니다. 억제가 자주 발생하는 경우 샘플 처리 또는 정량화 방법을 추가로 최적화해야 합니다.

음성 제어

폐수 샘플을 추가하지 않고 RNA를 추출하여 추출 블랭크를 만듭니다. 이러한 제어법은 추출 시약 오염을 감지하는 데 사용됩니다. 각 추출 샘플 세트에 포함시킵니다.

"템플릿 제어 없음"은 폐수 샘플 핵산 추출물을 추가하지 않는 분자 반응 시약입니다. 이러한 제어법을 사용하여 분자 시약 오염을 감지하고 모든 PCR 기기 실행에 포함합니다.

생물안전

폐수에서 SARS-CoV-2를 농축하려면 바이오 에어로졸 생성 공정이 필요합니다. CDC는 호흡기 보호 및 개인보호장비 착탈 지정 구역을 포함하여 단방향 기류 및 BSL-3 예방 조치를 갖춘 생물 안전성 레벨2(BSL2) 시설에서 이러한 공정을 수행할 것을 권장합니다. SARS-CoV-2를 포함할 수 있는 폐수 샘플의 실험실 폐기물은 BSL2 생물안전지침에 따라 오토클레이브(가압 멸균처리)하고 관리해야 합니다.

저온 살균

폐수 샘플 처리 중 바이오 에어로졸 생성 절차로 인한 생물 안전 위험을 줄이기 위해 폐수 샘플을 저온 살균합니다. 저온 살균 포함 여부를 결정할 때 다음 사항을 고려해야 합니다.

  • 폐수의 경우 저온 살균이 PCR에 의해 표적화한 짧은 RNA 단편을 손상하는 정도는 알려지지 않았습니다.
  • 피어리뷰 보고서에 따르면 30분 동안 56ºC에서 호흡계 표본을 열처리하면 RNA 측정에 발생하는 변화는 무시할 만한 수준임이 밝혀졌습니다.
  • 일부 연구자들은 60ºC에서 폐수를 열처리하면 SARS-CoV-2 RNA 측정을 개선할 수 있다고 보고했지만 이 효과를 확인하려면 더 많은 데이터가 필요합니다.